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蛋白免疫印迹法实验操作指南
来源：js3333线路检测中心生物 发布时间 ：2019-12-12 10:37 点击量：
蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot 。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息 。具体操作流程如下：
一、蛋白样本的制备
1.样本的处理
（1）组织样本处理：取待测组织样本，用预冷的PBS洗去组织表面血液及内 部杂物 。称重剪碎 ，加入适量RIPA裂解液混合物（ 1mL的RIPA裂 解液中加入10μL PMSF）进行匀浆裂解。匀浆后冰上震荡裂解60min。在35%-40％的功率下，超声处理样本1min（冰浴条件下进行），超声2s，间隔2s，确保细胞充分裂解，降低样本粘度 。4℃，12,000rpm离心5min，取上清待测定蛋白浓度。
（2）细胞样本处理：收集待测细胞样本 ，用预冷的PBS洗去培养基等成分。加入适量RIPA 裂解液混合物（1 mL 的 RIPA 裂解液中加入 10μL PMSF）进行冰上 裂解 60min。在 35%-40％的功率下，超声处理样本 1min（冰浴条件下进行） ，超声2s，间隔 2s ，确保细胞充分裂解 ，降低样本粘度。4℃ ，12,000rpm 离心 5min，取上清待测定蛋白浓度 。
2.测定浓度
BCA 法测定蛋白浓度（Cat# K001）
3.收样及保存
用 PBS 调整蛋白浓度，按照蛋白样本 ：5×SDS 上样缓冲液=4：1 的比例加入 5×SDS 上样缓冲液 ，沸水煮 10min。12,000rpm 离心 2min，收取上清即可进行后续的 Western Blot 实验，或保存于 -20℃或-80℃ 。
注 ：待测样本建议总蛋白上样量为 50-100μg，尽量保持各待测样本上样体积接近 10μL 。
二 、电泳
1.根据靶蛋白的分子量的大小，配制不同浓度的分离胶 。每个泳道加入待测样本 ，并预留一个泳道加入 5μL 的预染蛋白 Marker，以验证目的分子量大小及转膜程度。加入 1×电泳缓冲液，开始电泳。
2.90v 恒压电泳，待溴酚蓝指示剂移动至浓缩胶与分离胶交界处成线状，改为恒压 120v跑完全程 ，直至电泳结束。
三、转膜（湿转）
1.根据靶蛋白的分子量选择不同孔径的PVDF或NC 膜 。膜先在甲醇中浸泡 5min 使其活化 ，然后将膜浸泡于1×转膜缓冲液（含 20％甲醇）中 。同时将滤纸和纤维垫也浸泡在转膜缓冲液中待用。
2.按照黑色板（负极）-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF或NC膜-滤纸-纤维垫-白色板（正极）依次放好 ，排出气泡 ，夹紧后放入湿转电转槽内。根据靶蛋白分子量调整转膜条件 。请务必保证转膜过程在低温条件下进行 。
注：此为湿转的参考步骤，如用其他转膜方法 ，请依具体情况进行调整 。
3.转膜完成后，小心取出NC膜，TBST洗涤1min。
四、免疫印迹
1.用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液（封闭液）浸泡PVDF或NC膜 ，室温摇床封闭 1.5h。
2.用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液按照说明书推荐的稀释比稀释相应的抗体 ，使 NC 膜浸泡于一抗孵育液中 ，4℃摇床孵育过夜。
3.TBST 充分洗涤 NC 膜 3 次，15min/次。
4.用含 5%脱脂奶粉的 TBST 溶液按照说明书推荐的稀释比稀释相应的二抗，室温摇床孵育 1h。
5.TBST 充分洗涤 NC 膜 3 次 ，15min/次。
五、显色曝光
1.将ECL 化学发光检测试剂盒（Cat# K026）中的 A 液与 B 液按 1:1 比例混匀。
2.NC 膜从 TBST 洗液中取出后用滤纸吸干水分，均匀滴加ECL 混合液于 NC 膜上，排出气泡，即可曝光。
3.调节对比度，多次曝光获取最佳图片效果 。
蛋白免疫印迹法自发明以来被广泛应用于现代生物学研究中的蛋白质定性和半定量分析，尤其在医疗方面的应用有着巨大的影响和发展空间。
一、蛋白样本的制备
1.样本的处理
（1）组织样本处理：取待测组织样本，用预冷的PBS洗去组织表面血液及内 部杂物 。称重剪碎 ，加入适量RIPA裂解液混合物（ 1mL的RIPA裂 解液中加入10μL PMSF）进行匀浆裂解。匀浆后冰上震荡裂解60min。在35%-40％的功率下，超声处理样本1min（冰浴条件下进行），超声2s，间隔2s，确保细胞充分裂解，降低样本粘度 。4℃，12,000rpm离心5min，取上清待测定蛋白浓度。
（2）细胞样本处理：收集待测细胞样本 ，用预冷的PBS洗去培养基等成分。加入适量RIPA 裂解液混合物（1 mL 的 RIPA 裂解液中加入 10μL PMSF）进行冰上 裂解 60min。在 35%-40％的功率下，超声处理样本 1min（冰浴条件下进行） ，超声2s，间隔 2s ，确保细胞充分裂解 ，降低样本粘度。4℃ ，12,000rpm 离心 5min，取上清待测定蛋白浓度 。
2.测定浓度
BCA 法测定蛋白浓度（Cat# K001）
3.收样及保存
用 PBS 调整蛋白浓度，按照蛋白样本 ：5×SDS 上样缓冲液=4：1 的比例加入 5×SDS 上样缓冲液 ，沸水煮 10min。12,000rpm 离心 2min，收取上清即可进行后续的 Western Blot 实验，或保存于 -20℃或-80℃ 。
注 ：待测样本建议总蛋白上样量为 50-100μg，尽量保持各待测样本上样体积接近 10μL 。
二 、电泳
1.根据靶蛋白的分子量的大小，配制不同浓度的分离胶 。每个泳道加入待测样本 ，并预留一个泳道加入 5μL 的预染蛋白 Marker，以验证目的分子量大小及转膜程度。加入 1×电泳缓冲液，开始电泳。
2.90v 恒压电泳，待溴酚蓝指示剂移动至浓缩胶与分离胶交界处成线状，改为恒压 120v跑完全程 ，直至电泳结束。
三、转膜（湿转）
1.根据靶蛋白的分子量选择不同孔径的PVDF或NC 膜 。膜先在甲醇中浸泡 5min 使其活化 ，然后将膜浸泡于1×转膜缓冲液（含 20％甲醇）中 。同时将滤纸和纤维垫也浸泡在转膜缓冲液中待用。
2.按照黑色板（负极）-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF或NC膜-滤纸-纤维垫-白色板（正极）依次放好 ，排出气泡 ，夹紧后放入湿转电转槽内。根据靶蛋白分子量调整转膜条件 。请务必保证转膜过程在低温条件下进行 。
注：此为湿转的参考步骤，如用其他转膜方法 ，请依具体情况进行调整 。
3.转膜完成后，小心取出NC膜，TBST洗涤1min。
四、免疫印迹
1.用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液（封闭液）浸泡PVDF或NC膜 ，室温摇床封闭 1.5h。
2.用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液按照说明书推荐的稀释比稀释相应的抗体 ，使 NC 膜浸泡于一抗孵育液中 ，4℃摇床孵育过夜。
3.TBST 充分洗涤 NC 膜 3 次，15min/次。
4.用含 5%脱脂奶粉的 TBST 溶液按照说明书推荐的稀释比稀释相应的二抗，室温摇床孵育 1h。
5.TBST 充分洗涤 NC 膜 3 次 ，15min/次。
五、显色曝光
1.将ECL 化学发光检测试剂盒（Cat# K026）中的 A 液与 B 液按 1:1 比例混匀。
2.NC 膜从 TBST 洗液中取出后用滤纸吸干水分，均匀滴加ECL 混合液于 NC 膜上，排出气泡，即可曝光。
3.调节对比度，多次曝光获取最佳图片效果 。
蛋白免疫印迹法自发明以来被广泛应用于现代生物学研究中的蛋白质定性和半定量分析，尤其在医疗方面的应用有着巨大的影响和发展空间。
