a)用包被缓冲液稀释单克隆抗体
，浓度分别为10ug/ml、5.0ug/ml、2.5ug/ml、1.0ug/ml, 包被酶标板

，每一浓度包被1横行
，每孔100ul
。4 ℃过夜包被，洗涤3次；

 

b)5%脱脂奶粉封闭酶标板
， 37℃孵育1h，洗涤3次；

 

c) 在每条包被孔中加入空白对照和标准品
，每个空白对照和标准品为一组
，依次加入，各100ul，37℃孵育1h
，洗涤3次
；

 

d) 在每一包被浓度的一挑中分别加入按1:2000、1
：4000、1：8000
、1:16000 稀释的兔多抗
， 37℃孵育1h，洗涤3次；

 

e) 在每一包被浓度的一条中分别加入HRP标记羊抗兔igG
，稀释度先按说明书上的推荐稀释比进行稀释，37℃孵育30min，洗涤5次
；

 

f) 加TMB底物
，37℃避光显色10-15min，用2mol/L H2SO4终止反应
，酶标仪450nm读取吸光度（OD）值；

 

g) 测得的标准品OD值在2.0左右，阴性对照OD值小于0.1的组合为较理想的组合
。

 

可根据初步确定的浓度缩小间距,再做进一步棋盘滴定,寻找最佳包被条件
。

 

注意

：抗体做稀释时最好用同一个原始浓度做倍比稀释

，这样可以尽量减少由于加样枪造成的误差及人为误差。

加样方法参考下表：

注
：1.  1,2,3,4条分别包被不同浓度单抗，如红色框所示；2.纵列分别加入标准品和blank孔，相应加入稀释好的多抗；3.整板加入推荐稀释比的二抗。

由此表可以看出，选择包被1ug/ml，多抗用1:4000，效果最佳
。